Während der Reformation entschloss sich die Regierung Freiburgs in den Jahren nach 1520, beim alten Glauben zu bleiben. Daraufhin wurden die Stadt und ihre Landschaft zur katholischen Insel mitten in protestantischem Gebiet; über ein Jahrhundert bestimmte der Religionszwist die Freiburger Politik. Nach aussen verhielt sich die Obrigkeit in konfessionellen Belangen tolerant, gegen ihre Untertanen jedoch unnachgiebig.
Die katholische Kirche reagierte auf die Erschütterung der Reformation mit einer inneren Erneuerung («Gegenreformation» oder «katholische Reform»). Anlässlich des Konzils von Trient (1545–1563) wurden Richtlinien festgelegt, welche Ernsthaftigkeit und Selbstdisziplin in den Vordergrund stellten und das religiöse Leben einer verstärkten Kontrolle unterwarfen. Die Stadt Freiburg versuchte zunächst, diese Kontrollfunktion selber wahrzunehmen, indem sie eine eigene Reform durchführte. Auf ihre Machtstellung bedacht, lehnte sie es lange Zeit ab, den aus Lausanne vertriebenen Bischof aufzunehmen. Erst als ab 1688 das Amt von einem Freiburger bekleidet wurde, akzeptierte die Stadt den Würdenträger endgültig in ihren Mauern.
Als wichtige Massnahme gegen das Vordringen der Reformation wurde in ganz Europa ein Bildungswesen aufgebaut, das die (männliche) Elite auf die Verteidigung des katholischen Glaubens vorbereitete. Die Jesuiten, die hierin spezialisiert waren, gründeten 1580 auf Geheiss des Papstes das Freiburger Kollegium, eine Schule für Knaben etwa ab dem zwölften Altersjahr. Zu Beginn war hier Petrus Canisius tätig, ein berühmter niederländischer Jesuit.
In der Folge siedelten sich auch weitere Ordensgemeinschaften, die während der Gegenreformation entstanden waren, in Freiburg an: 1608 waren es – vom Rat berufen – die Kapuziner; 1626 dank einem frommen Gönner die Kapuzinerinnen. Zwei weitere Frauenorden, die Ursulinen und die Visitandinnen, hatten wegen des Dreissigjährigen Kriegs hier Zuflucht gesucht (1634, 1635); ihnen gewährte man das Aufenthaltsrecht erst später.
Das Freiburger Kunstschaffen war um 1600 noch mittelalterlich geprägt («Nachgotik»). Erst Jahrzehnte später wurde die kantige Formenwelt durch eine neue, geschmeidigere abgelöst («Barock»). Stärker als zuvor versuchte man in katholischen Gegenden nun, das Religiöse sinnlich erfahrbar zu machen: in der Pracht eines Kirchenraums sollte der Gläubige die Herrlichkeit Gottes erahnen.
